L'Ensemble nacque a Grosseto nel 1983 come coro polifonico inteso all'esecuzione di musica vocale del Rinascimento; l'iniziativa fu di alcuni studiosi della vocalità del '500 sostenuti da un gruppo di appassionati di musica e di canto.
Nell'intento di ampliare il proprio repertorio e allo stesso tempo di indirizzarsi verso una resa vocale più raffinata, il sodalizio nel 1992 assunse la struttura e il nome di Ensemble Polifonico; i cantori divennero un numero più limitato, ma la cura e l'attenzione verso una migliore qualità delle esecuzioni vennero concretamente privilegiate. L'attività dell'Ensemble si esplicava attraverso due formazioni: il gruppo femminile e il coro misto.
Il Gruppo Femminile indossava un costume riprodotto da un modello originale del '500 che contribuiva a creare una particolare atmosfera durante le esecuzioni. L'attuale repertorio parte dal Canto Gregoriano e giunge fino al XXI secolo: Palestrina, Monteverdi, Di Lasso, Da Victoria, Pergolesi, Mozart, Bach, Poulenc. Da alcuni anni e grazie all'impegno dell'attuale direttore del coro Massimo Merone, l'Ensemble Polifonico Giovanni Pierluigi da Palestrina ha allargato il proprio repertorio ad autori contemporanei di nuova avanguardia corale polifonica. L'Ensemble ha avuto modo di esibirsi in manifestazioni diverse e in numerose città italiane ed all'estero, esibendosi in concerti sinfonici con orchestre ed a cappella, in varie manifestazioni canore, tra le quali:

• Nel 1985 partecipa al Llangollen International Musical Eisteddfod, Galles - Regno Unito;
• Nel 1996 Alla Basilica Superiore di San Francesco d'Assisi, l'Ensemble Palestrina esegue la prima assoluta del Song of Peace di Federico Bonetti Amendola sotto la direzione dello stesso Maestro Amendola;
• Nel 1992 e nel 2001 partecipa a due tournée in Danimarca, a Copenaghen;
• Nel 2004 partecipa al Praga Cantat a Praga ottenendo particolari consensi di giuria e pubblico;
• Nel 2011 esegue il Requiem in Re min. Op. 48 di Gabriel Fauré per soli, coro ed orchestra;
• Nel 2015 esegue il Gloria RV589 per soli, coro ed orchestra di Antonio Vivaldi;
• Nel 2017 esegue nuovamente il Requiem in Re min. Op. 48 per soli, coro ed orchestra di Gabriel Fauré;
• Nel 2018 in due repliche successive, a Roma e Grosseto, con un gruppo formato da 5 corali esegue la IX Sinfonia Op. 125 "Corale" per soli, coro ed orchestra di Ludwig van Beethoven.

Nel giugno del 2019 l'Ensemble, trasformatosi in associazione di promozione sociale, ha effettuato l'aggiornamento del proprio statuto al Codice del Terzo Settore e contemporaneamente si è iscritto al Registro Regionale del Terzo Settore per la Regione Toscana. Con la costituzione del registro unico nazionale degli enti del Terzo Settore (RUNTS), è stato iscritto di diritto per trasmigrazione aggiungendo la qualifica di ente del Terzo Settore (ETS).
L'ensemble fa parte di Act, associazione cori della Toscana e di FENIARCO, federazione nazionale delle associazioni cori regionali.